BMBF Verbundprojekt

Freisetzungsbegleitende Sicherheitsforschung transgener (Diabrotica resistenter) Maissorten mit neuen Bt-Genen: Entwicklung und Validierung von Monitoringmethoden (SiTraMaisBt)

Teilprojekt
Validierung eines Nematodenbiotests zum Nachweis der Bioverfügbarkeit und Toxizität von Bt Toxinen im Boden
(Förderkenzeichen 0313279B)

Ziele

Die Freisetzung von gentechnisch veränderten Pflanzen (GVP) erfordert laut der EG-Freisetzungsrichtlinie (2001/18/EG) eine Umweltverträglichkeitsprüfung, um von Fall zu Fall etwaige direkte, indirekte, sofortige oder spätere Auswirkungen auf die Umwelt ermitteln und evaluieren zu können. Durch den Anbau von transgenem Mais, auf den Gene des insektizid wirkenden Bodenbakteriums Bacillus thuringiensis übertragen wurden (B.t.-Mais) können sich die von der Pflanze produzierten Toxine im Boden anreichern und somit auch für Nichtziel-Organismen ein potentielles Risiko darstellen. Ob diese B.t.-Toxine tatsächlich ein Risiko für einzelne Organismengruppen darstellt, ist abhängig von der Struktur des jeweiligen Toxins, der Beschaffenheit des betreffenden Bodentyps (Stichwort Bioverfügbarkeit) und der Empfindlichkeit des Organismus. Dieses Risiko kann also nur durch Biotestverfahren mit Bodenorganismen evaluiert werden.
In dem hier durchgeführten Projekt sollte ein Biotest mit dem Nematoden Caenorhabditis elegans als Mittel zur Umweltverträglichkeitsprüfung validiert werden. Dies sollte im Rahmen des Verbundprojekts Freisetzungsbegleitende Sicherheitsforschung transgener Maissorten mit neuen Bt-Genen: Entwicklung und Validierung von Monitoringmethoden anhand einer neuen transgenen Maissorte (Mon863) exemplarisch exerziert werden, deren Toxin (Cry3Bb) sich gegen den Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera virgifera) richtet. Eine standardisierte Testmethode (ISO New Work Item Proposal) erlaubt eine schnelle und kostengünstige Evaluierung der Toxizität bioverfügbarer B.t.-Toxine in Bodenproben auf ökologisch relevante, subletale Parameter (z.B. Reproduktion). Mit Nematoden als Testorganismen erfasst man außerdem eine für die Funktionalität des Agrarökosystems Bodens sehr wichtige Organismengruppe.
Durch die Untersuchung von Umweltproben mit Hilfe des Nematodentests (Vergleich von transgenen mit isogenen Maissorten) und zusätzlichen Laborversuchen mit isolierten Toxinen läßt sich das Risikopotential einer Freisetzung von neuen B.t.-Maissorten einfach und kostengünstig abschätzen.

Wissenschaftliche und Technische Arbeitsziele des Vorhabens

Zwei wesentliche Ziele sollten in diesem Vorhaben erreicht werden:

(a) Erforschung der Bioverfügbarkeit und Toxizität von B.t.-Toxinen für C. elegans

Durch Laborexperimente mit reinen B.t.-Toxinen, die in verschiedenen Medien angereichert wurden, sollten Erkenntnisse zur Bioverfügbarkeit des Toxins in verschiedenen Böden und zur Empfindlichkeit des Testorganismus für das entsprechende Toxin gewonnen werden. Die Wechselwirkung zwischen Toxin, Boden (bzw. verschiedenen Bodenmatrizes) und Bodenorganismus ist ein ökotoxikologisch sehr interessantes Thema und deshalb von allgemeinem wissenschaftlichen Interesse. Zum anderen dienten die Versuche dazu, die Ergebnisse aus Versuchen mit Freilandproben richten einschätzen zu können.

(b) Validierung eines Verfahrens zur ökotoxikologischen Untersuchung von mit B.t.-Toxinen belasteten Böden

Durch die Beobachtung eines Standortes über einen Zeitraum von drei Jahren, an dem sowohl transgene, als auch isogene Maissorten angebaut wurden, sollte die Eignung des Nematodentests als Mittel der Umweltverträglichkeitsprüfung in der freisetzungsbegleitenden Forschung überprüft werden. Ziel war, ein kostengünstiges Biotestverfahren in die Hand zu bekommen, das eine ökologisch sehr bedeutsame Organismengruppen im Boden, die Nematoden, berücksichtigt.

Ausführliche Beschreibung des Arbeitsplans

Um bereits unmittelbar zu Beginn im ersten Versuchsjahr die Wirkung von Cry3Bb1 auf C. elegans abschätzen zu können, wurde absprachegemäss mit den Verbundpartnern Pflanzenmaterial von Diabrotica-resistenten Bt-Pflanzen mit dem Nematodentest untersucht. Sobald das reine Cry3Bb-Toxin zur Verfügung stand, konnten echte Dosis-Wirkungs-Versuche durchgeführt werden.

Pflanzenmaterial von transgenen und isogenen Maispflanzen wurde getrocknet und fein zermahlen. Der Pflanzenpulver wurde nun in Flüssigmedium (Phosphatpuffer) suspendiert. In den Pflanzenmaterialien enthaltenes Toxin war so zum Teil (bis zur Gleichgewichtseinstellung) in Lösung gegangen. C. elegans wurde dann im Versuch dem Toxin über die gelöste Phase als auch über die feinen Partikel, die die Nematoden aufnehmen können, ausgesetzt. Durch eine Beladungsreihe sollte eine Art Dosis-Wirkungsbeziehung aufgestellt werden. Als Kontrolle diente Material der isogenen Pflanze, sowie zweier konventioneller Maissorten.

Um Dosis-Wirkungskurven für das relevante Toxin (Cry3Bb1) zu erhalten, wurde Flüssigmedium (Phosphatpuffer) mit reinem Toxin (Bereitstellung durch AG Jehle ab Ende 2005) angereichert. Die bereitgestellten Toxinlösungen wurden zu Stammlösungen gewünschter Konzentration verdünnt. Als Kontrolle diente der Puffer in dem das Toxin gelöst und verdünnt wurde.

Um Dosis-Wirkungskurven für das relevante Toxin (Cry3Bb1) in verschiedenen Medien zu erhalten, sollten drei verschiedene künstliche Böden mit reinem Toxin (Bereitstellung durch AG Jehle ab Ende 2005) angereichert werden. Die Zusammenstellung der Böden wurde in enger Absprache mit der AG Gessler und Tebbe vorgenommen, da auch Sorptionsversuche mit den entsprechenden Böden durchgeführt wurden. Durch die Variation der Testmatrix wurden die potentiellen Aufnahmepfade für die Nematoden variiert. Die gleichzeitige Erfassung von Toxizität und Toxinbindungsverhältnissen (AG Gessler) ermöglichte eine Abschätzung der Bioverfügbarkeit des Toxins im Boden.

Im Verbundprojekt "Freisetzungsbegleitende Sicherheitsforschung transgener Maissorten mit neuen Bt-Genen: Entwicklung und Validierung von Monitoringmethoden" wurde ein Standort mit vier verschiedenen Maissorten bepflanzt. Als transgene Sorte wurde Mon88017 genutz, eine isogene und zwei weitere Maissorten sollten als Kontrollen dienen. Jede Sorte sollte dabei auf acht Parzellen (Wiederholungen) angebaut werden. Es ergab sich also eine Gesamtzahl von 32 zu untersuchenden Parzellen.

Jede der zu untersuchenden Parzellen sollte an zwei unterschiedlichen Zeitpunkten im Jahr beprobt werden. An jedem Termin sollte freie Erde (oberste 20 cm-Schicht) beprobt werden, an einem Termin im Jahr auch Wurzelanhangserde (im ersten Jahr entfiel allerdings der erste Probenahmetermin für freie Erde).

Im Rahmen des Verbundprojekts wurden von der AG Schuphan Mesokomen eingerichtet, die mit Pflanzenstreu von vier verschiedenen Maissorten (siehe Feldversuch: transgener Mais, isogener Mais, sowie zwei weitere konventionelle Maissorten) behandelt wurden. Die Untersuchung von Proben aus den Mesokosmen mit dem Nematodentest ermöglichte eine Verknüpfung der Spiking-Versuche mit reinem Toxin und Pflanzenstreu auf der einen Seite und den Bodenproben aus dem Feldversuch auf der anderen Seite.

Insgesamt wurden pro Jahr 32 Mesokosmen (8 Mesokosmos-Replikate pro Maissorte) aufgestellt. Am Ende des Versuchs (Oktober 2005, 2006 und 2007) standen dann jeweils 32 Proben zur Untersuchung mit dem Nematodentest zur Verfügung.

Zusammenarbeit mit Dritten

Der Einbezug in ein Verbundprojekt ist für dieses Teilvorhaben sehr wichtig, da die Ergebnisse eine wesentlich höhere Relevanz bekommen, wenn sie mit anderen wichtigen Parametern, die für die gleichen Versuchsfelder erhoben wurden, im Zusammenhang diskutiert werden können. Folgende Kooperationen bestanden im Rahmen des Verbundprojekts:

• AG Jehle: Verwendung von gereinigten Toxinen im Nematodentest
• AG Schuphan: Verwendung von Pflanzenmaterial und Bodenproben aus Mesokosmen für Nematodentest, Nutzung der Versuchsfreifläche
• AG Tebbe: Quantitative Analyse von von Toxin in Bodenproben
• AG Gessler: Untersuchung der Toxin-Sorptionsverhalten verschiedener Böden; Analyse wichtiger geochemischer Bodeneigenschaften